El proyecto tiene como objetivo principal determinar la viabilidad de una nueva estrategia terapéutica combinando un anticuerpo monoclonal (Adalimumab) y un material inteligente desarrollado en AIMPLAS que actúe como portador. Dicho proyecto se enmarca dentro de una colaboración entre el grupo de Biomedicina Molecular, Celular y Genómica y AIMPLAS. La acción sinérgica de ambas unidades permite abordar la nueva estrategia debido a los conocimientos farmacológicos y de materiales inteligentes. Una vez finalizado este proyecto, se pretende continuar con la colaboración de los dos centros a través de la solicitud de fondos de I+D+I, bien nacionales bien internacionales, para continuar con el desarrollo de la nueva estrategia terapéutica. Las degeneraciones retinianas son la principal causa de ceguera caracterizada por la pérdida de las células fotorreceptoras (bastones y conos). La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad rara que constituye la principal causa genética de ceguera en el mundo desarrollado. Su prevalencia es de un afectado por cada 4000 habitantes estimándose que alrededor de dos millones de personas padecen esta enfermedad en el mundo. Los pacientes con RP suelen perder la visión nocturna en la adolescencia, la visión periférica en la edad adulta temprana y la visión central a una edad más avanzada debido a la muerte progresiva de bastones y conos. Actualmente hay descritos más de 70 genes implicados en la patogénesis de la RP . La muerte de los fotorreceptores comienza con la degeneración de los bastones y con el tiempo degeneran los conos. Es probable que la muerte de los conos, responsables de la visión central, esté influenciada por la liberación de sustancias tóxicas por parte de los bastones y otras células del entorno como la microglía. La muerte de estos conos es el principal problema que afecta a los pacientes con RP ya que provoca la pérdida de la visión central. Diversos estudios sugieren que la muerte de estos conos es consecuencia del progresivo daño oxidativo, inflamación, desequilibrio metabólico, etc. Existen estudios sugieren un importante componente inflamatorio en la progresión de la RP. Por ejemplo, la activación de la microglía, un evento común presente en degeneraciones retinianas heredadas o inducidas, se ha descrito en pacientes y modelos murinos de RP. La activación microglial conduce a la proliferación, migración al sitio dañado y liberación de citoquinas (TNFα, IL-1α, IL-1β), quimioquinas, neurotrofinas, glutamato, etc. para reparar el daño tisular. Esta activación precede o coincide con el pico de muerte de los fotorreceptores y con niveles elevados de TNFα. Además, la inhibición de la activación microglial reduce la muerte de los fotorreceptores, el contenido de TNFα y mejora la función visual en modelos murinos de RP. Se ha descrito una inflamación crónica en el ojo de pacientes con RP y en ratones rd10. El grupo BMCGen retinas de ratón rd10 y en el modelo ex vivo de degeneración retiniana en cerdo. En la retina, el TNFα puede activar vías de supervivencia o de muerte celular (dependientes o independientes de caspasas como la necroptosis o necrosis programada) a través de su unión a receptores TNFR1.

Actividad preparatoria 1: Analizar si la inyección intravítrea de Adalimumab es efectiva para prevenir la degeneración retiniana en ratones rd10 Finalmente, elegimos una concentración y una edad para la inyección. Los estudios preliminares han mostrado que los animales no presentan efectos secundarios aparentes hasta P23. Además mediante técnicas histológicas hemos determinado un efecto neuroprotector de la administración ivt de ADA al menos hasta P20. También hemos determinado marcadores de respuesta antioxidante aunque los resultados aún no son concluyentes. Actividad preparatoria 2: Evaluar la toxicidad in vitro de los biopolímeros. Se analizó la citotoxicidad de PLGA en las células 661W y se incluyó otra línea celular de macrófagos murinos, la línea RAW 264.7. Incluimos esta línea ya que son estas células las principales productoras de TNFα. Se realizaron ensayos de viabilidad celular MTT. Actividad preparatoria 3: Síntesis de nanocápsulas de ácido glicólico y láctico e inclusión de Adalimumab. Para ello se determinó la utilización de nanocápsulas, formadas a su vez también por polímeros biodegradables compatibles, que encierren en su interior la dosis adecuada del tratamiento, que estén dispersas en el sol-gel, protegiendo así el ADA de los disolventes en los que está disuelto, y haciendo de barrera protectora a la vez que de método de control en su liberación. Se han llevado a cabo diferentes estudios con nanocápsulas, cuya síntesis se realiza por un proceso de doble emulsión, el cual se detalla a continuación: El ADA es homogeneizado con una disolución formada por una fase orgánica inmiscible con la fase acuosa, en la cual se encuentra el polímero principal de las nanocápsulas, así como un agente emulsificante, que permita una correcta dispersión de ambas fases y la retención del anticuerpo en la fase interior. Este proceso se realiza gracias a un sonicador. A continuación, una segunda disolución formada por una fase acuosa con una concentración variable de Polivinil Alcohol, es añadida a la emulsión anterior, volviéndose a emulsionar gracias a la utilización del sonicador. Una vez realizado esto, la doble emulsión (fase acuosa/fase orgánica/fase acuosa), es llevada a agitación magnética por un periodo siempre superior a 24h, con el fin de evaporar todo el disolvente orgánico presente en ella. Por último se procede a la separación de las nanopartículas formadas, y su purificación gracias a una centrifugadora. 2. Síntesis de nanocápsulas para estudios de toxicidad de los biopolímeros. No se apreciaron diferencias en cuanto al rendimiento de la síntesis de cápsulas modificando los ratios de lactida frente a glicida. Finalmente, para el estudio de toxicidad de las cápsulas se utilizó un ratio de 75:25 de lactida frente a glicida. 3. Síntesis de nanocápsulas para estudios de eficacia de inclusión de ADA. Una vez realizadas tanto la síntesis de nanocápsulas por diferentes métodos, y la síntesis con diferentes materiales, se procedió a la etapa de síntesis de estas con el principio activo en el interior ActIvidad preparatoria 4: Incorporar los anticuerpos en los biopolímeros seleccionados Los resultados de expresión génica fueron similares. Recientemente estimulamos las células 661W con tunicamicina para aumentar la producción de TNFα. Los resultados preliminares muestran que la tunicamicina es capaz de aumentar tres veces el contenido de TNFα en las células 661W. En estas células la concentración de ADA más alta empleada, es deci